一、原理
本試劑盒采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物青霉素將和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)青霉素抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物青霉素的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較可得出相應(yīng)殘留物青霉素的含量。
二、試劑盒特性
試劑盒靈敏度： 0.05ppb
樣本定量檢測(cè)下限
組 織———————1ppb
蜂蜜、牛奶—————————————1ppb
交叉反應(yīng)率
青霉素——————100%
氨芐青霉素———————0.8%
鄰氯青霉素—————————0.2%
雙氯青霉素——————————————0.1%
阿莫西林—————————0.1%
頭孢塞呋—————————0.1%
樣本回收率
組 織——————————————85±10%
蜂蜜、牛奶————————————70±10%
三、 試劑盒組成
1、 微量測(cè)試孔：每條8孔，一板12條
2、 標(biāo)準(zhǔn)液×6瓶：（1ml/瓶）0ppb、0.05 ppb、0.15 ppb、0.45ppb、1.35ppb、4.05 ppb
3、 酶標(biāo)記物 12ml ……………紅色帽
4、 抗體工作液 7ml ……………藍(lán)色帽
5、 底物 A 液 7ml……………白色帽
6、 底物 B 液 7ml ……………黑色帽
7、 終止液 7ml ……………黃色帽
8、 20X濃縮洗滌液 40ml …………白色帽
9、 2X濃縮復(fù)溶液 50ml …………透明帽
四、所用儀器、試劑
具備的儀器：微孔板酶標(biāo)儀、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀/氮
氣吹干裝置、均質(zhì)器、振蕩器、
離心機(jī)、刻度移液管、天平（感量0.01g）
微量移液器：?jiǎn)蔚?/span> 20µl-200µl、100µl-1000多道250µl
試 劑：氫氧化鈉、乙腈、正己烷、去
離子水、亞硝基鐵氰化鈉、硫酸鋅、2M H2SO4、濃鹽酸
五、樣本前處理步驟
樣本處理前須知
處理任何樣本時(shí)，都必須注意：
（a）本試劑盒所檢測(cè)的組織樣本包括：動(dòng)物組織、禽類和水產(chǎn)組織。eg:雞、鴨、牛、羊、兔、魚、蝦等。
（b）實(shí)驗(yàn)中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時(shí)要更換吸頭。
（c）實(shí)驗(yàn)之前須檢查各種實(shí)驗(yàn)器具是否干凈，必要時(shí)可對(duì)實(shí)驗(yàn)器具進(jìn)行清潔，以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
樣本前處理需配制：
配液1、用去離子水將2×濃縮復(fù)溶液按1：1稀釋（1份濃縮復(fù)溶液+1份去離子水）用于樣本復(fù)溶。
配液2、0.1M NaOH溶液
0.4gNaOH加去離子水100ml溶解。
配液3、乙腈-0.1MNaOH溶液
84ml乙腈16ml 0.1M NaOH混合均勻。
配液4、C液： 0.36M 亞硝基鐵氰化鈉
（Na2Fe（CN）5·NO·2H2O）
稱取10.7g亞硝基鐵氰化鈉加入去離子
水100ml溶解。
配液5、 D液：1M硫酸鋅（ZnSO4·7H2O）
28.8g硫酸鋅加入去離子水100ml溶解。
配液6、酸化乙腈溶液
100ml乙腈加入150µl 2M H2SO4混合均勻。
配液7、1M鹽酸溶液
41.7ml濃HCL加入去離子水定容至500ml混勻。
配液8、1M NaOH溶液
4g NaOH加去離子水100ml溶解。
（a）組織（雞、鴨、豬肉/豬肝、蝦、魚）前處理方法
1、 用均質(zhì)器均質(zhì)組織樣本；
2、 稱取2±0.05g于50ml離心管中，加入8ml乙腈-0.1M NaOH溶液，渦旋2min，振蕩5min，室溫4000r/min以上，離心10min；
3、 取出1ml上清液，在56℃條件下氮?dú)饣蚩諝饬鞔抵?干燥；
4、 加入1 ml正己烷溶解干燥殘留物，再加1ml稀釋后的復(fù)溶液充分混勻30s，室溫4000r/min以上，離心5min；
5、 去除上層正己烷相，下層水相按1：4（50µl樣本液加200µl稀釋后的復(fù)溶液）稀釋，混合30s；
6、 取50 µl用于分析。
樣本稀釋倍數(shù)：20
（b）蜂蜜
1、 準(zhǔn)確稱取4±0.05g蜂蜜樣本于離心管中，加入0.5ml 1M NaOH振蕩混勻后靜置20min；
2、 加入0.5ml 1M HCl，振蕩混勻（pH應(yīng)在3左右，若沒在此范圍請(qǐng)用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)至準(zhǔn)確），再加入7ml酸化乙腈（pH4.0左右），充分振蕩5min，室溫4000r/min 以上離心10min；
3、 取上清液3ml，在56℃條件下氮?dú)饣蚩諝饬鞔抵?干燥；
4、 加1ml稀釋后的復(fù)溶液溶解干燥殘留物；
5、 取液體用稀釋好的復(fù)溶液按1：19（20µl樣本液+380µl稀釋后的復(fù)溶液）稀釋，混合30s；
6、 取50µl用于分析。
樣本稀釋倍數(shù)：20
（c）牛奶
牛奶樣本處理方法一
1、 取2ml鮮牛奶于5ml離心管，加入50µlC液混勻；
2、 加入50 µl D液振蕩1min，10℃ 4000r/min以上離心10min；
3、 取上層清亮液體用稀釋好的復(fù)溶液按1： 19（20µl樣本液+380µl稀釋后的復(fù)溶液）稀釋，混合30s；
4、 取50µl用于分析。
注：如果離心后仍然渾濁，再重復(fù)沉淀過程。
樣本稀釋倍數(shù)：20
牛奶樣本處理方法二
1、 取2ml去除脂肪奶樣至離心管中；
2、 加入8ml乙腈-0.1M NaOH充分振蕩5min，15℃ 4000r/min以上離心10min，取1ml上清液，在56℃條件下氮?dú)饣蚩諝饬鞔抵?干燥；
3、 用1ml正己烷溶解干燥的殘留物后，再加入1ml稀釋后的復(fù)溶液混合30s，離心去除正己烷相；
4、 取下層相用稀釋好的復(fù)溶液按1：3 （50µl樣本液加150µl稀釋后的復(fù)溶液）稀釋，混合30s；
5、 取50µl用于分析。
樣本稀釋倍數(shù)：20
六、 酶標(biāo)免疫分析程序
測(cè)定前應(yīng)須知：
1、 使用之前將所有試劑和需用板條的溫度回升至室溫（20-25℃）。
2、 使用之后立即將所有試劑放回2-8℃。
3、 在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測(cè)定程序中的要點(diǎn)。
4、 在所有恒溫孵育過程中，避免光線照射，用蓋板膜封住微孔板。
操作步驟：
1、 從4℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑，置室溫（20-25℃）平衡30min以上, 注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
2、 取出框架及需要數(shù)量的微孔，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。
3、 配液：將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。
4、 編號(hào)：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào),每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行,并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。
5、 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加抗體50µl/孔，用蓋板膜封板，輕輕振蕩混勻。37℃環(huán)境中反應(yīng)30min。
6、 取出將孔內(nèi)液體甩干，用洗液250µl/孔，洗板4-5次，每次間隔15-30秒，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
7、 每孔加入酶標(biāo)記物100µl，蓋板膜蓋板后置37℃環(huán)境中反應(yīng)30min。將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌液充分洗板4-5遍（同上），用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
8、 顯色：每孔加入底物A液50µl，再加底物B液50µl，輕輕振蕩混勻，37℃環(huán)境中避光顯色15min。
9、 測(cè)定：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（建議用雙波長(zhǎng)450/630nm檢測(cè)，在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)），測(cè)定每孔OD值。
七. 結(jié)果判定
結(jié)果判定有兩種方法,粗略判定可用第1種方法,定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與青霉素的含量成負(fù)相關(guān)。
1、 粗略判定
用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出其濃度范圍（ppb）。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.310，樣本2的吸光度值為0.820，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是：0ppb為1.610；0.05ppb為1.350；0.15ppb為1.030；0.45ppb為0.660；1.35ppb為0.389；4.05ppb為0.198。則樣本1的濃度范圍是1.35ppb-4.05ppb；樣本2的濃度范圍是0.15 ppb-0.45ppb。再乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中青霉素實(shí)際濃度。
2、 定量分析
（1）百分吸光率的計(jì)算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以*個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值，再乘以100%，即
| 百分吸光度值（%）＝ | B | ×100% |
| B0 |
B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值
B0—0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值
（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算
以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以青霉素標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ng/ml）的半對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中青霉素實(shí)際濃度。
若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。（索?。?/span>
八. 注意事項(xiàng)
1、 室溫低于20℃或試劑及樣本沒有回到室溫（20-25℃）會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。
2、 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會(huì)伴隨著出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。
3、 試劑混合要均勻，否則會(huì)出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。
4、 反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。
5、 不要使用過了有效期的試劑盒，稀釋或攙雜使用會(huì)引起靈敏度、OD值的變化。不要交換使用不同批號(hào)的盒中試劑。
6、 試劑變質(zhì)的跡象
顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5個(gè)單位（A450nm<0.5 ）時(shí)，表示試劑可能變質(zhì)。
7、 加A、B 液后一般顯色15min即可，若顏色較淺，可延長(zhǎng)顯色時(shí)間，但不能超過30min。
8、 該試劑盒*反應(yīng)溫度為37℃，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測(cè)吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。
九、儲(chǔ)藏條件和保質(zhì)期
儲(chǔ)藏條件：試劑盒于2-8℃保存，不要冷凍。
保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見包裝盒。
提示：酶標(biāo)板真空包裝袋若有漏氣，酶標(biāo)板仍然正常有效，不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，請(qǐng)放心使用。
